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RNAi基因干擾

時間:2015-12-25 作者:市場部 文章來源: 瀏覽:3362

RNA干擾整體實驗服務—RNAi基因干擾


RNA干擾(RNAi基因干擾、SiRNA實驗):RNA干擾(RNA interfering,RNAi)現象是指由與靶基因序列同源的雙鏈RNA(DsRNA)引發的基因轉錄后的沉默過程,小干擾RNA特異性介導相同序列的mRNA降解,阻斷相應基因表達。艾柏森生物提供的RAN干擾技術包括化學合成小RNA片段(SiRNA)和構建載體RNA(SnRNA)兩種形式。實驗委托者只需提供干預基因名稱或基因序列ID,艾柏森生物免費設計合適的干預位點,保證至少有一對小RNA有效抑制目的基因表達,抑制效率不低于70%。


RNA干擾(SiRNA實驗)流程
第一步 確定干擾基因,設計并合成合適的小干擾RNA(片段型或載體型小干擾RNA)。
第二步  預轉染實驗,進行細胞培養,摸索轉染條件、時間并進行必要的檢測(WB、PCR等),確定干預效果最佳的一對小RNA。
第三步  正式實驗,設置合理實驗分組,進行瞬時或穩定轉染。
第四步  轉染后檢測,根據實驗要求選擇細胞生物學檢測、蛋白檢測、分子生物學檢測等。以研究小干擾RNA對于細胞、蛋白或基因功能的影響。


RNA干擾(SiRNA實驗)檢測(可根據委托者實驗需求選擇做)
1. 細胞檢測:細胞增殖毒性MTT、細胞凋亡、細胞周期、細胞遷移、細胞侵襲;
2. 蛋白檢測:免疫印跡WB、免疫細胞化學ICC、免疫熒光IF、流式細胞術FCM、酶聯免疫ELSIA;
3. 分子生物檢測:RT-PCR、實時熒光定量PCR、甲基化特異性PCR(MSP);
4. 其他檢測:生化檢測、酶類檢測、脂類檢測、糖類檢測。


實驗案例: YYYY細胞在XXXX基因干擾后的增殖及侵襲能力實驗
第一部分:實驗細胞篩選
一、免疫熒光實驗

實驗試劑:PBS(磷酸鹽緩沖液pH7.4),非免疫山羊血清,Triton X-100,BSA抗體稀釋液,XXXX蛋白一抗 (1:100),二抗AlexaFluor 555 goat anti-rabbit IgG (H+L) *2 mg/mL*(A21428)
免疫熒光(IF)染色:倒出細胞培養液,PBS沖洗三次;2-4%甲醛固定15分鐘;1×PBS緩沖液(0.01 M,pH7.4)洗滌3次,每次5分鐘;滴加非免疫山羊血清(內含0.3%Triton X-100)封閉液,覆蓋液面2-3mm,室溫放置60min,甩去多余液體;滴加一抗plscr1 50μL(1:100),4℃過夜;PBS洗3次,每次5分鐘;滴加熒光標記的上述二抗50μL(1:200),室溫 60分鐘;PBS洗3次各5min;熒光顯微鏡下觀察、拍照,每指標照相2套圖像。
IF染色結果(400倍): 通過熒光染色可以分析出,XXXX蛋白在YYYY細胞中表達量最突出。

YYYY細胞


RNAi基因干擾


AAAA細胞   

RNAi基因干擾


BBBB細胞


RNAi基因干擾    

CCCC細胞


RNAi基因干擾

二、RT-PCR實驗
實驗材料:細胞樣品4份,分組編號(見圖片標示)
試劑:TrizolReagent,Invitrogen  Cat.NO.15596-026;ReverTraAce-α-TM  First Strand cDNA Synthesis Kit ,TOYOBO#FSK-100;PCR Master Mix(2x) Fermentas # K0172;DNA Marker DL2,000, TaKaRa D501A;0.1%DEPC水、氯仿(分析純)、異丙醇(分析純)75%乙醇;AGAROSE(瓊脂糖)  AMRESCO,K499;10×DNA上樣緩沖液, 美國ProMab,SJ-R2008523;0.5mg/ml EB 溶液,實驗室常備;1×TBE, 實驗室常備,配方參照《分子克隆實驗指南 第二版》
儀器:PCR儀,ABI9600;電泳儀,北京六一儀器公司,DYCP-31DN型;高速離心機,湘儀H1650-W; 紫外分光光度計,上海江儀儀器有限公司,UV-7502C(751);成像系統,柯達紫外顯相系統 400W像素
引物資料:
Homo- XXXX-F    5-cacccatgtctaccaaagtt -3,Homo-XXXX-R    5- ctctcaaaattccagtccag -3,片段長度: 175bp
Homo-GAPDH-F  5-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3,Homo-GAPDH-R  5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3,片段長度   450bp
實驗步驟:
1、RNA提取:每樣本加入1mlTrizol試劑消化(組織約50mg—100mg充分剪碎,細胞約106—107);勻漿樣品在室溫靜置5~10min后加入0.2倍體積的氯仿,震蕩15秒后在2~8℃下12,000×g離心15min;將水樣層轉移至干凈的試管,加入0.5倍體積的異丙醇,混勻后-20℃下靜置10-15min,在2~8℃下12,000×g離心10min;移去上層懸液,將RNA沉淀用1ml 75%乙醇洗滌,在震蕩器上混勻后2~8℃下7,500×g離心5min,棄去上清液;適度干燥RNA沉淀后,加入適量0.1% DEPC水,使RNA完全溶解;2000rpm離心20sec
2、總 RNA 定量:紫外分光光度計開機預熱30 min;用蒸餾水洗滌石英比色皿,吸水紙吸干,加入DEPC水后,放入樣品室的S池架上,關上蓋板;設定紫外光波長(260nm、280nm)后校零(每次檢測前均需調零);將待測樣品適當稀釋(RNA 1μl用DEPC水稀釋至250μl)后,記錄編號和稀釋度;把裝有稀釋后待測樣品的比色皿放進樣品室的S架上,關閉蓋板;分別測定260nm和280nm波長時的OD值(吸光度在0.1—0.5范圍為最佳);用蒸餾水洗滌石英比色皿,酒精浸泡。
3、實驗結果判斷:純DNA:OD260/OD280≈1.8(>1.9,表明有RNA污染;<1.6,表明有蛋白質、酚等污染) 純RNA:OD260/OD280≈2.0(<1.7時表明有蛋白質或酚污染;>2.0時表明可能有異硫氰酸殘存)

樣本編號

稀釋倍數

A260

A280

A260/A280

RNA濃度(ug/ul)

YYYY

250

0.348

0.179

1.944

3.48

AAAA

250

0.289

0.151

1.914

2.89

BBBB

250

0.302

0.159

1.899

3.02

CCCC

250

0.333

0.171

1.947

3.33


計算A260/ A280比值,比值≥1.8,滿足實驗要求。        
RT-PCR實驗步驟:
產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測:擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳,加樣量為10μl(DNA樣本8μl+上樣緩沖液2μl) ,電壓120V ,電泳完畢后在溴化乙錠( EB)中染色約15分鐘,清水漂洗后凝膠成像系統拍照。
凝膠圖片與平均光密度值:陽性條帶以Gelpro4.0 版凝膠光密度分析軟件進行分析,測其IOD值。


RNAi基因干擾


點樣說明及IOD參考值分析:

泳道

1

2

3

4

樣品

YYYY

AAAA

BBBB

CCCC

XXXX基因

15930

8099

10591

12963

R

0.603

0.325

0.438

0.545

泳道

5

6

7

8

樣品

YYYY

AAAA

BBBB

CCCC

GAPDH

26431

24934

24206

23786


R值為目的基因PLSCR1參考IOD值/內參基因GAPDH參考IOD值
XXXX基因在YYYY細胞中表達量最突出。


三、WB實驗
實驗試劑:XXXX蛋白多抗(1:400),37Ka;GAPDH單抗(1:1000),37Ka;RabbitAnti Goat IgG/HRP(1:30,000);GoatAnti mouse IgG/HRP(1:50,000)
WB操作流程:
實驗結果:陽性條帶以Gel pro4.0 版凝膠光密度分析軟件進行分析,測其IOD(integrated optical density)累積光密度參考值。


Lanes:

Lane  1

Lane  2

Lane  3

Lane  4

Rows

(IOD)

(IOD)

(IOD)

(IOD)

XXXX

131.69

51.667

65.03

97.148

GAPDH

283.05

282.52

290.29

289.44

樣本

YYYY

AAAA

BBBB

CCCC


XXXX蛋白在YYYY細胞中表達量最高。
通過上述實驗,確定有YYYY細胞來進行XXXX基因沉默實驗最具意義。


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